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论文题名(中文):

 羊驼产毛性能与毛色形成机制的研究

作者:

 姜俊兵

论文语种:

 chi

学科名称:

 动物遗传育种与繁殖

学位:

 农学硕士

学校:

 山西农业大学

院系:

 动物科技学院

专业:

 动物遗传育种与繁殖

研究方向:

 羊驼毛色形成机制

第一导师姓名:

 董常生

论文完成日期:

 2008-05-02

论文题名(外文):

 Fiber Performance and Coat Color Genesis in Alpaca (Lama pacos)

关键词(中文):

 羊驼 毛用性状 被毛颜色 黑色素细胞 黑色素细胞发生 黑色素细胞功能调节 色素颗粒转运 多巴染色 免疫组织化学 半定量RT-PCR real-time RT-PCR PCR-SSCP

关键词(外文):

 Alpaca fiber characteristic Coat color melanocyte melanocyte genesis melanin granules transportation Dopa staining Immunohistochemistry semi-quantitative RT-PCR real-time RT-PCR PCR-SSCP

论文文摘(中文):

羊驼是我国于2002年引进的家养动物新物种,毛用性状是其最主要的经济性状。从上个世纪80年代后期开始,羊驼养殖及羊驼毛纤维生产,在世界畜牧产业中占有越来越重要的地位和比重。羊驼在我国经过五年多时间的适应性扩繁、科学实践与成果推广,已经取得了较为显著的成果,但是羊驼在中国大陆养殖生境下的产毛性能指标还未系统研究;羊驼作为优良的毛用动物,其毛色性状具有22种相对稳定的天然色泽,这与其它毛用家畜具有鲜明的差异,羊驼被毛颜色性状不仅具有重要的经济价值,而且也是研究哺乳动物包括人类毛发色素沉积机理的理想实验动物。

基于此,本研究从三个角度立题,设计相互关联的八个试验展开研究。

1、选择剪毛两次以上的成年羊驼68头,分别取样,测定纤维直径、自然长度、伸直长度、弯曲度和有髓纤维比率;统计分析性别、被毛颜色、年龄等对原毛产量以及测定指标的影响,并分析测定指标间的相关程度;

2、采用组织化学研究、免疫组织化学、mRNA半定量、实时荧光定量等方法,以黑素皮质激素受体-1(MC1R)、骨形态发生蛋白-2/4(BMP-2/4)、酪氨酸酶(TYR)、干细胞因子信号系统(SCF/c-KIT)和蛋白酶激活受体-2(PAR-2)为研究靶向,研究羊驼不同颜色被毛皮肤组织(毛囊)中黑色素细胞的分化、迁移、分布、活性以及色素颗粒转运机制;

3、借鉴人类及实验动物小鼠的研究方法,以MC1R基因为研究靶向,采用PCR-SSCP技术,分析中国羊驼种群内该基因的分型情况。

结果显示:

1、羊驼的平均原毛产量与国外报道结果相近,性别与年龄显著影响毛纤维遗传性状(P<0.05),性状间相关分析与国外报道结果一致。供试羊驼平均纤维直径低于澳大利亚、美国等国的研究报道;伸直长度与澳大利亚、新西兰等国的报道数据相近,低于美国、秘鲁等国报道的数据,其他性状分析结果与国外报道相似。笔者分析,羊驼在我国养殖过程中发生的经济性状改变,可能主要源于饲养管理方式及营养水平的改变;

2、多巴活性黑色素细胞在羊驼不同颜色被毛皮肤组织中均有分布,但在毛根成形部的分布数量为有色被毛毛囊显著高于白色被毛;作为成熟黑色素细胞分子标记的MC1RTyrosinase,其mRNA表达水平在不同颜色被毛皮肤组织中表达量差异显著(P<0.05),免疫组织化学进一步定位分析显示,Tyrosinase在有色被毛毛根成形部呈强阳性反应,白色被毛毛根部呈阳性反应,结合多巴染色结果,说明,成熟黑色素细胞在不同颜色被毛毛根成形部数量差异是羊驼被毛颜色差异的细胞学基础。

BMP-2/4参与了羊驼毛囊黑色素细胞的调控,半定量分析显示,BMP-2/4在有色被毛皮肤组织高量表达(P<0.05),BMP-2参与上调Tyrosianse的表达,所得结果与国外同行研究结论一致,而BMP-4抑制黑色素细胞的分化和增殖,在有色被毛皮肤组织中高量表达的结果与试验预期不一致。

SCF/c-KIT信号系统参与黑色素细胞的分化、迁移和分布。mRNA荧光定量分析证明,c-KIT在不同颜色被毛皮肤组织表达差异不显著(P>0.05),而SCF mRNA在有色被毛皮肤组织中的表达显著高于白色被毛(P<0.05),免疫组化定位发现,c-KIT在有色被毛毛根成形部呈强阳性反应、毛根永久部呈阳性反应,在白色被毛毛根永久部呈强阳性反应、毛根成形部表达量很低;SCF在有色被毛毛根成形部呈阳性反应、永久部呈弱阳性反应,在白色被毛毛根成形部和永久部的表达量均非常低,综合分析可以推知,在羊驼毛囊中存在黑色素细胞储库和黑色素细胞干细胞池,SCF/c-KIT信号系统的作用可从发育生物学角度为揭示羊驼不同被毛颜色形成提供一定的理论依据。

PAR-2参与了羊驼毛囊色素颗粒的转运。荧光定量分析发现,在有色被毛皮肤组织中PAR-2基因高量表达,提示羊驼被毛颜色形成不仅仅取决于毛囊黑色素细胞的数量、活性,同时也依赖于毛囊色素单位中角化细胞对色素颗粒的接受程度。

    3、中国羊驼MC1R基因具有多态性。PCR-SSCP分析证明在中国羊驼种群内MC1R基因具有两个基因型(AAAB),突变位点检测发现在该基因对应于已经公布的羊驼MC1R的编码区第206号氨基酸发生了突变,由异亮氨酸(I)突变为缬氨酸(V),是否该突变与毛色性状存在相关,有待进一步研究证实。

文摘(外文):

It was the first time that Huacaya alpaca was imported into P.R. China from Australia in the 2002. At the beginning of 1980s, alpacas were introduced to many countries from South America which brought a fast development for alpacas industries throughout the world. Now, alpaca fiber has become one kind of the important product from natural fiber producing animal. Many scientific researches have been developed, but their productivity hasn’t been investigated under the changed situation from Australia to China. Alpaca’s coat color is one of the most important phenotype differs from other fiber producing animals, because it has 22 kinds of stable natural color. Not only the coat color phenotype has important economic value, it is also perfect animal model for studying the mechanism for mammal hair shaft color genesis.

In this paper, eight experiments were designed, based on three theses, to study the fiber performance and coat color genesis mechanism of alpaca.

1. Two hundreds and four Huacaya alpaca’s fiber samples were obtained, which were sheared from 68 alpacas at different body regions of neck (N), mid side (M), and thigh (T), respectively. The sampled alpacas included 21 parental generations (three male) imported from Australia and others were their offspring. Total greasy fiber yield (GFY) of sampled alpacas were measured at shearing time in May from 2003 to 2007. The fiber samples measurements include relaxed staple length (RSL), strengthened staple length (SSL), fiber crimpy (FC), mean fiber diameter (MFD) and medullation proportion (MP).

2. Histochemistry, immnohistochemistry, mRNA semi-quantify and real-time RT-PCR were executed to study those target gene/protein, included MC1R, BMP-2/4, TYR, SCF/c-KIT signaling system and PAR-2. Hope to show light on the mechanism of melanocyte differentiation, migration, distribution, activity and melanin granules translocation in follicles of alpaca with different coat color phenotype.

    3. Referred to the methods developed in study on MC1R genotype of human and model animal mice. PCR-SSCP were used to analyze the MC1R gene polymorphism among Chinese alpaca population.

    Results showed:

    1. The greasy fiber yield of Huacaya alpaca reared in China was similar to that reported throughout the world and the fiber traits were significantly affected by sex and age (P<0.05). The mean fiber diameter of sampled alpacas was thinner than that in Australia and the U.S., and the strengthened staple length was similar to that in Australia and New Zealand, shorter than that in the U.S. and Peru. Based on these results, we can conclude that the fiber traits change should be attributable to the different feeding management and nutritional level.

2. Dopa positive melanocytes distributed both in skins with pigmented hair and with natural white hair. The amounts of Dopa positive melanocytes distributed in hair root transient portion of pigmented hair are significantly higher than in natural white hair. The mRNA expression of MC1R and TYR are both significantly different in skins with pigmented coat color and natural white coat colorP<0.05. Higher expression of MC1R and TYR in pigmented coat color skin indicates there has more mature melanocytes. TYR immunolocalization showed strong positive reaction in pigmented hair root transient portion, positive reaction in natural white hair root permanent portion. Based on results of Dopa staining, mRNA semi-quantitative analysis and immunolocalization, we could give such a conclusion that the cellular mechanism for different coat color genesis of alpaca is the difference of mature melanocytes distributed in hair root transient portion.

BMP-2/4 involves the regulation of hair follicle melanocytes of alpaca. The mRNA of BMP-2 more highly expressed in skin with pigmented hair than natural white one, similar results have been reported in other mammal researches that proofed the BMP-2 up-regulates TYR mRNA expression. BMP-4 reported such a function that it inhibits mammal melanocytes differentiation and proliferation. BMP-4 mRNA highly expressed in skin with pigmented coat color, the results differed from experiment anticipation.

SCF/c-KIT signaling system involves melanocytes differentiation, migration and distribution in hair follicles of alpaca. The c-KIT mRNA expression showed no significant difference among skins with different coat color (P>0.05), but the SCF mRNA expressed significantly higher in skin with pigmented hair coat than in skin with natural white hair coat (P<0.05). Results of c-KIT immunolocalization showed strong positive reaction in hair root transient portion and positive reaction in permanent portion of pigmented hair, strong positive reaction in hair root permanent portion and weak positive reaction of natural white hair. SCF localized in hair root transient portion and weak stained in permanent portion, while little staining was observed in hair follicle of natural white hair. Then we inferred that there exists melanocyte reservoir and stem cell pool in hair follicle of alpaca. In developmental biology view, SCF/c-KIT signal pathway involving the coat color genesis of alpaca.

PAR-2 involved transportation of melanin granules of hair follicle of alpaca. Results from real-time RT-PCR showed that PAR-2 mRNA higher expression in skin with pigmented hair coat. These finding indicated that the coat color genesis depended on not amounts and activity of mature melanocytes, but the receptive ability of keratinocytes in melanin units of hair follicle.

    3. The MC1R gene existed polymorphism in Chinese alpaca population. Results of PCR-SSCP showed that there existed two genotypes (AA and AB). Amino acid residue I replaced by V at the site of 206. Whether this mutation correlated with coat color genesis, need further study to confirm.

论文目录:

第一章  文献综述. 1


1羊驼生物学概述. 2


1.1 的起源与进. 2


1.2的分类学地位. 3


1.3 南美小型骆驼物比生物特性. 4


2  羊驼的分及毛用性能研究进展. 5


2.1  分布及生产概况. 5


2.2  毛用性能及其. 6


2.2.1  纤维直径. 7


2.2.2  纤维长. 8


2.2.3 原毛产量. 8


2.2.4 被毛颜色. 9


2.2.5 国内外研究进展. 9


3 哺乳动物毛色发生机制研究进展. 9


3.1  毛囊及毛囊周期. 10


3.1.1 毛囊形态发生学. 10


3.1.2 毛发生长初期. 10


3.1.3 毛发生长初期到毛发生长中期的过渡期. 11


3.1.4 毛发生长中期. 11


3.1.5 毛发生长终期. 11


3.1.6 毛囊干细胞层. 11


3.1.7  毛发生长终期与毛发生长初期的过渡期. 11


3.2 黑色素胞的分化、移和定位. 12


3.2.1 毛囊色素单位的发生. 12


3.2.1  SCF/c-Kit在MC迁移、存活中的作用. 14


3.3  BMP在毛囊及毛囊色素生成程中的作用机制. 15


3.3.1 BMP在胚胎期毛囊形态发生中的作用. 16


3.3.2 BMP在出生后毛囊形态发生过程中的作用. 16


3.3.3 BMP在毛根细胞分化中的作用. 16


3.3.4 不同毛囊周期BMP及其受体的表达. 17


3.4  黑色素合成的分子和机制. 17


3.4.1  黑色素生化及生理特性. 17


3.4.2  MC1R特性及其在黑色素合成过程中的作用机制. 18


3.5 黑色素粒的胞间转运——MCKC的互作. 20


3.5.1 PAR-2与黑色素颗粒的膜胞转运研究进展. 20


3.5.2 KC对MC活性的影响. 22


4 羊驼毛色形成机制研究进展. 22


5 选题依据及研究目的、意义. 22


5.1 学问题. 22


5.1.1 国内羊驼引种后,还没有系统建立羊驼产毛性能有关资料. 22


5.1.2 哺乳动物表皮MC与毛囊MC在迁移、增殖及凋亡机制方面存在差异,国内外研究哺乳动物毛色形成机制方面存在一些误区. 23


5.1.3 哺乳动物毛色发生的细胞及分子机制研究依旧非常困难,特别是在色素颗粒的细胞间转运研究空白很多. 23


5.2 试验设计. 23


5.3 究目的意. 24


参考文献. 25


第二章  人工草地划区轮牧羊驼产毛性能研究. 31


1 材料与方法. 31


1.1 羊驼养殖环境. 31


1.2 试验动物及样品. 32


1.3 测定方法. 33


1.4 统计分析. 33


2 结果与分析. 33


2.1 测定数据统计结果. 33


2.2 统计分析. 35


2.2 测定指标间相关性分析结果. 37


2.3 引进羊驼与本地生羊驼产毛性能比较结果. 40


3 结论与讨论. 41


参考文献. 43


第三章  羊驼皮肤组织黑色素细胞组织化学研究. 44


1 材料与方法. 44


1.1 材料. 44


1.2 仪器设备与试剂. 45


1.2.1 主要仪器设备. 45


1.2.2 主要试剂及其配制. 45


1.3 方法. 45


1.3.1 甲苯胺蓝染色. 45


1.3.2 多巴染色. 46


1.3.3.多巴-甲苯胺蓝复染. 46


2 结果与分析. 46


2.1 甲苯胺蓝染色结果. 46


2.2 多巴染色结果. 47


2.3 多巴-甲苯胺蓝复染结果. 47


3 讨论. 47


3.1 羊驼皮肤组织学结构特征. 47


3.2 多巴染色结果分析. 47


3.3 多巴-甲苯胺蓝复染结果分析. 48


4 小结. 48


参考文献. 49


第四章 MC1R在不同被毛颜色羊驼皮肤组织表达水平研究. 55


1 材料与方法. 55


1.1 材料. 55


1.2 方法. 56


1.3半定量RT-PCR扩增条件筛选. 57


1.4 琼脂糖凝胶电泳. 58


1.5 半定量RT-PCR分析. 58


1.6 MC1R基因序列测定及分析. 58


2 结果与分析. 58


2.1 羊驼皮肤总RNA提取结果. 58


2.2 羊驼皮肤总RNA的纯度鉴定及定量. 58


2.3 扩增循环数筛选结果. 59


2.4 半定量RT-PCR扩增结果. 60


2.5 RT-PCR产物测序结果. 61


2.6 羊驼MC1R基因cDNA与其它动物的相似性比较. 62


3 讨论. 62


3.1 半定量RT-PCR技术体系应用效果分. 62


3.2 MC1R在不同被毛颜色皮肤组织中的表达. 63


3.3 扩增片段碱基突变分析. 64


参考文献. 65


第五章  BMP-2/4 mRNA在羊驼皮肤组织中的表达. 66


1 材料与方法. 66


1.1 材料. 66


1.1.1 主要试剂. 66


1.1.2 主要仪器设备. 66


1.2 方法. 67


1.2.1 半定量 RT-PCR 引物设计与合成. 67


1.2.2  羊驼皮肤总RNA的提取. 67


1.2.3  RNA的纯度鉴定及定量. 67


1.3 半定量RT-PCR扩增条件筛选. 67


1.3.1 反转录反应. 67


1.3.2 退火温度筛选. 67


1.3.3 最适反应循环数筛选. 67


1.4 琼脂糖凝胶电泳. 68


1.5 半定量RT-PCR分析. 68


1.6 BMP-2和BMP-4序列测定及分析. 68


2 结果与分析. 68


2.1 羊驼皮肤总RNA提取结果. 68


2.2 羊驼皮肤总RNA的鉴定及定量结果. 68


2.3 最适循环数筛选结果. 68


2.4 半定量RT-PCR扩增结果. 69


2.4.1 BMP-2半定量分析结果. 69


2.4.2 BMP-4半定量分析结果. 71


2.5 RT-PCR产物测序结果. 72


2.5.1 BMP-2测序结果. 72


2.5.2 BMP-4测序结果. 72


2.6 羊驼BMP-2/4基因cDNA与其它物种的相似性比较. 72


3 讨论. 73


参考文献. 75


第六章  酪氨酸酶在羊驼皮肤组织中的表达与定位研究. 76


1 材料与方法. 76


1.1 材料. 76


1.1.1 材料. 76


1.1.2 主要试剂. 76


1.1.3 主要仪器设备. 76


1.2 方法. 77


1.2.1 羊驼皮肤总RNA分离、鉴定及定量. 77


1.2.2 半定量RT-PCR引物设计与合成. 77


1.3半定量RT-PCR扩增条件筛选. 77


1.3.1  反转录体系. 77


1.3.2 PCR反应体系及条件优化. 78


1.3.3最适反应循环数筛选. 78


1.4 琼脂糖凝胶电泳. 79


1.5 半定量RT-PCR分析. 79


1.6 TYR免疫组化定位分析. 79


1.6.2 免疫组织化学定位. 79


2 结果与分析. 80


2.1 TYR半定量研究结果. 80


2.1.1 羊驼皮肤总RNA提取结果. 80


2.1.2 羊驼皮肤总RNA的纯度鉴定及定量. 80


2.1.3 扩增循环数筛选结果. 80


2.1.4 半定量RT-PCR扩增结果. 81


2.1.5 RT-PCR产物测序结果. 82


2.1.6 羊驼TYR基因cDNA序列与其它物种的相似性比较. 82


2.2 氨酸酶免疫组织化学研究结果. 83


3 讨论. 83


小结. 84


参考文献. 86


第七章  SCF/c-KIT在羊驼毛囊黑色素细胞分化、增殖和定位中的作用机制研究  92


1 材料与方法. 92


1.1 材料. 92


1.2 仪器设备与试剂. 92


1.2.1 主要仪器设备. 92


1.2.2 主要试剂. 93


1.3 方法. 93


1.3.1 样品的固定与包埋. 93


1.3.2  SCF/c-KIT在羊驼皮肤的免疫组织化学定位. 93


1.3.3  SCF/c-KIT mRNA表达量real-time PCR分析. 94


2 结果与分析. 95


2.1 免疫组化结果. 96


2.1.1 c-KIT免疫组化结果. 96


2.1.2 SCF免疫组化结果. 96


2.2 real-time PCR 分析结果. 96


2.2.1 实时荧光定量PCR反应体系及反应条件的优化. 96


2.2.2 标准曲线建立. 97


2.2.3 样品扩增动力学曲线. 98


2.2.4 样品扩增熔解曲线. 99


2.2.5 SCF/c-KIT mRNA表达量统计分析. 99


2.2.6 SCF/c-KIT mRNA扩增产物鉴定与序列分析. 99


3 讨论. 100


3.1 SCF/c-KIT在羊驼皮肤组织中的定位分析. 100


3.2 SCF/c-KIT mRNA在羊驼皮肤组织中的表达分析. 101


3.3羊驼毛囊中的黑色素祖细胞/干细胞存在的依据. 102


4 小结. 103


参考文献. 104


第八章 PAR-2基因在羊驼皮肤组织中的表达研究. 113


1 材料与方法. 113


1.1 材料. 113


1.2 仪器设备与试剂. 113


1.2.1 主要仪器设备. 113


1.2.2 主要试剂. 114


1.3 方法. 114


1.3.1 皮肤总RNA分离、鉴定及定量. 114


1.3.2 设计引物. 114


1.3.3 反转录合成第一链cDNA 114


1.3.4  实时荧光定量PCR反应体系及反应条件优化. 114


1.3.5 标准曲线的制作. 114


1.3.6 目的基因定量分析. 115


1.3.7 PAR-2 基因扩增产物测序鉴定与序列分析. 115


1.3.8 数据收集处理与分析. 115


2 结果与分析. 115


2.1 实时荧光定量PCR反应体系及反应条件的优化. 115


2.2 标准曲线建立. 115


2.3 样品扩增动力学曲线. 116


2.4 样品扩增熔解曲线. 117


2.5 PAR-2 mRNA表达量统计分析. 117


2.6 PAR-2 mRNA扩增产物鉴定与序列分析. 118


3 讨论. 118


3.1 PAR-2 mRNA表达量与毛干着色. 118


3.2 PAR-2 参与色素颗粒转运的机制. 119


3.3 PAR-2在色素转运中的功能所引出的科学启示. 119


参考文献. 121


第九章 中国羊驼种群MC1R基因SSCP分析. 122


1.材料与方法. 122


1.1 实验动物. 122


1.2 主要仪器设备. 122


1.3 主要试剂及相关溶液配制. 123


1.4 羊驼血液基因组DNA提取及检测. 123


1.5 引物设计. 124


1.6 PCR反应体系及退火温度优化. 124


1.7 产物检测. 124


1.8 PCR产物的SSCP分析. 124


1.9 PCR产物的测序. 125


2 结果与分析. 125


2.1 基因组DNA电泳检测结果. 125


2.2 PCR产物的检测结果. 125


2.3 SSCP分析结果. 125


2.4 扩增产物测序结果. 126


3 讨论. 127


3.1 PCR-SSCR方法的建立及应用. 127


3.2 哺乳动物MC1R基因多态性研究动态. 127


4 小结. 128


参考文献. 129


全文结论. 130


研究创新与展望. 131


附录:在读期间课题相关科研论著与成果. 132


    133

开放日期:

 2009-05-02

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